比色法

通常，有幾種方法，例如BCA，Bradford和Lowry。

Lowry方法: 基于最早的縮二脲反應，并加以改進。蛋白質(zhì)與Cu2反應產(chǎn)生藍色反應物。然而，與縮二脲相比，Lowry法更敏感。缺點是需要依次加入幾種不同的反應試劑; 反應時間長; 容易受到非蛋白質(zhì)物質(zhì)的影響; 含有EDTA、Triton x-100、硫酸銨等物質(zhì)的蛋白質(zhì)不適合這種方法。

BCA (Bicinchoninine acid assay) 方法: 這是一種更新，更敏感的蛋白質(zhì)測試方法。待分析的蛋白質(zhì)在堿性溶液中與Cu2反應生成Cu，其與BCA形成螯合物，形成在562nm處具有吸收峰的紫色化合物。該化合物與蛋白質(zhì)濃度有很強的線性關系，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。與Lowry法相比，操作簡單，靈敏度高。然而，類似于Lowry方法，它容易受到蛋白質(zhì)和洗滌劑的干擾。

Bradford方法: 該方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍反應產(chǎn)生有色化合物，其吸收峰為595nm。其最顯著的特點是靈敏度好，是Lowry和BCA測試方法的兩倍; 操作更簡單，速度更快; 只需要一種反應試劑; 化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結果；并且它與一系列干擾Lowry和BCA反應的還原劑 (例如DTT，巰基乙醇) 相容。然而，它仍然對洗滌劑敏感。主要缺點是不同的標準會導致同一樣品的結果差異較大，沒有可比性。

一些新的比色測定方法的研究人員可能會被各種比色方法的不一致結果所迷惑。他們應該相信哪種方法？由于各種方法的反應基團和顯色基團不同，同一樣品同時使用幾種方法得到的樣品濃度是不可比的。例如: Keller等人測試了人乳中的蛋白質(zhì)，通過Lowry和BCA測量的濃度顯著高于Bradford，具有顯著差異。即使測量相同的樣品，通過相同的比色法選擇的標準樣品也不一致，并且測試后的濃度也不一致。例如，當使用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)時，使用BSA作為標準品，濃度為1.34mg/ml，使用球蛋白作為標準品，濃度為2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，有必要參考待測樣品的化學成分，并找到化學成分相似的標準蛋白質(zhì)作為標準。此外，當使用比色法定量蛋白質(zhì)時，一個常見的問題是樣品的吸光度值太低，導致測得的樣品濃度與實際濃度之間存在較大差距。關鍵問題是，1011分光光度計的重要配件比色杯的顏色在反應后具有一定的半衰期，因此每種比色法都列出了反應測試時間，所有樣品 (包括標準樣品) 都必須在此時間內(nèi)進行測試。如果時間太長，則獲得的吸光度值變小，并且轉(zhuǎn)換的濃度值降低。另外，反響溫度、溶液ph值等也是影響試驗的重要身分。此外，使用塑料比色法非常重要。避免使用石英或玻璃比色皿，因為反應后的顏色會污染石英或玻璃，導致樣品吸光度值不準確。